第四十章 单细胞测序为何不能直接给出细胞类型

一 分离细胞改变了什么

当组织被表示为成千上万个表达向量时，细胞差异获得了前所未有的分辨率。原来被群体平均淹没的少数细胞、过渡状态和内部异质性，可以成为独立问题。但表达向量并不等于完整细胞，取得向量的过程也并非透明通道。单细胞研究首先面对一个朴素事实：为了测量细胞，研究者往往改变了细胞原先所在的组织条件。

组织解离既可能改变表达，也可能改变谁能被测到。脆弱细胞容易损伤，紧密嵌入组织的细胞可能较难释放，尺寸和形态也会影响它们进入检测体系的机会。因此一份数据中的细胞比例，通常同时包含组织原有组成和获得样本的选择效应。某类细胞较少，可能是真实稀少，也可能是其在制样过程中更容易丢失。

Denisenko等人2020年以成年小鼠肾脏比较不同制样与保存条件，并比较单细胞和单核数据，观察到应激表达及细胞组成的系统差别。[40-1] 这一结果首先适用于所研究的组织和工作流程，表明分离能够同时改变读数与样本组成。其他组织中的偏差方向和受影响细胞，需要分别判断。

对单个表达标记而言，解离诱发的应激可能与原本的生理状态相混。若多个原有类型共同出现一组应激表达，聚类可能把它们拉近，形成看似新的共同群体；也可能使同一类型被按受扰程度分开。此时分类变化既不是纯粹算法幻觉，也不一定代表组织内原有类型。它可能准确记录了真实发生、但发生于制样期间的状态改变。

单核测序提供另一种入口，却不能被视为无条件的真实基准。核内RNA与整个细胞的RNA组成不完全相同，不同细胞的核也可能以不同概率被回收。它能减轻某些完整细胞分离带来的困难，同时形成自己的观察范围。两种平台不一致时，合理问题是差异来自何种生物特征与测量选择的组合，而不是先指定一种平台永远正确。

还必须处理双细胞混入和环境RNA。两种不同细胞的表达合在一个记录中，可能形成貌似兼具双方标记的群体；邻近破裂细胞释放的RNA，也可能让一个细胞携带本不属于它的表达线索。若看到跨类型标记便宣布发现过渡细胞，容易把混合记录当成转换过程。相反，过滤过强又可能丢掉真正罕见的状态，所以异常记录需要按来源判断。

这使细胞身份成为有条件的判同问题。状态描述一个时刻或一段短时期的活动方式；类型是能够在一定条件范围内重复识别的较稳定细胞类别；谱系记录祖先与后代关系；轨迹则描述状态变化的顺序。四者可能相关，但没有任何一者自动包含其他三者。来自同一祖先的细胞可以分化为不同类型，不同来源的细胞也可能形成相近表达状态。

在本书的实践层分析中，D包括分离、保存、测序和比较这些获得差异的过程。S是数据里显露的细胞簇或候选身份；E必须落实表达特征与取样位置、保存状况及功能判据怎样共同限定身份。若切断制样记录，研究者就可能把过程效应写成组织原有结构。保存这些记录不是附加技术细节，而是让“这个细胞属于哪一类”具有可核查含义的条件。

二 聚类决定来自哪些选择

从表达矩阵到彩色图块，中间存在一串分析选择。测序深度影响低丰度转录本能否被检出；归一化决定不同总量的细胞怎样比较；特征选择决定哪些差异对距离贡献最大；降维与邻域构造改变局部关系的表示；聚类尺度又影响最终分出多少群。没有这些处理，数据难以解释；但处理完成也不意味着类型边界已经由自然直接写出。

一个细胞未检出某转录本，不能总被理解为绝不表达。有限采样使低丰度信号更容易缺失，因而零值同时可能来自真实低表达和观测限制。若分类完全依赖单个稀疏标记，深度差异便可能改变成员归属。多个相互支持的特征和独立重复可以提高判断可靠性，但也需要防止它们只是同一技术偏差的多种表现。

归一化解决的是可比性问题，同时包含关于变化方式的假定。若某些细胞整体RNA含量不同，把总量差异全部去除可能抹掉真实生物差别；若完全不调整，又可能让检测效率主导距离。因此分析者需要说明研究目标是相对表达构成、绝对含量的差异，还是两者兼顾。一个处理步骤适合某个问题，并不保证它适合所有细胞身份问题。

批次整合具有同样的双向风险。不同批次的技术差别可能把同类细胞分开，校正有助于恢复共同结构；但若疾病状态、年龄或组织区域与批次完全重合，算法就难以知道该消除哪一部分。整合后的漂亮重叠并不能证明问题已解决。相反，过度重叠可能掩盖真正的生物差异，必须用独立样本和保留的外部信息判断。

聚类分辨率改变时，一个大群可以分成多个小群。新增群体可能揭示此前忽略的稳定亚型，也可能只是连续状态被划成多个区间。两种结果在图上都能表现为边界。要确定其含义，应检查边界是否跨样本稳定、是否预测独立性质，以及细胞是否在正常条件下频繁穿越。不能以“算法找到了几个簇”回答“自然共有几种细胞”。

二维可视化尤其容易造成过度确定感。图块间的空隙、方向和形状，取决于高维数据如何被压缩，不都对应真实组织距离或发育时间。两个群在图中靠近，不自动意味着彼此可以转换；一条连接细带，也可能受细胞采样密度影响。可视化适合提出问题，关于距离和连通性的结论则要回到模型所保留的具体关系。

轨迹推断更进一步：它尝试把不同细胞的快照排列成变化次序。这个次序通常是伪时间，不是每个细胞被实际连续观察的时钟记录。算法可能需要起点、分支数或拓扑假设，而采样不充分又可能遗漏短暂中间状态。Saelens等人2019年的方法比较显示，不同方法的表现与数据规模及轨迹结构有关，选择应与问题相匹配。[40-2]

因此，伪时间顺序正确也不自动等于谱系关系正确。两个不同来源的细胞可能经历相近表达程序，使算法把它们放在一条连续线上；同一谱系中的细胞也可能由于快速转换而在快照中相距较远。排列提供关于状态变化的模型，谱系则需要关于继承关系的证据。把“相似的先后”写成“真实的亲子”，是从统计关系向历史关系的越级。

分析选择并不使结果任意。一个候选类型若在不同合理处理、不同个体和独立读数中持续可辨，其证据会增强。反过来，只有某一种精确参数组合才能出现的簇，应被赋予较弱的身份。这里的稳健性不是要求所有算法给出完全相同数字，而是检查核心生物判断是否依赖无充分理由的选择，并明确哪些边界仍是工作假说。

从S进入的路径在这里很自然：先看到一个新簇，再追问它如何由D产生，最后通过E检查表达与空间、谱系及功能是否相互支持。若从D进入，研究者则可能先比较平台差异，再问哪些群稳定存在。两种次序改变优先审查的问题，却不预先决定新簇真假。它们共同阻止显露形式被过早升级为生命身份。

三 功能与谱系独立验证

独立验证首先意味着证据不只是原分类依据的重复。用同一组标记先分群，再证明每群拥有这些标记，并没有增加多少身份依据。若分类提出某群具有特定功能，就需要观察相应活动；若声称群体具有特定来源，就需要追踪继承；若声称它属于组织某个区域，就需要空间定位。每种主张应由能够对其提出反驳的证据承担。

神经元提供了有力案例。Gouwens等人2020年在小鼠视觉皮层抑制性神经元中联合研究转录、内在电生理与形态，提出跨模态相互支持的类型分类。[40-3] 其价值并非证明表达簇总能一一对应功能，而在于让不同性质彼此预测并显露不一致。论文同时报告离散与连续差异，这使分类能够保留层次，而不是把每个测量维度压成同样的边界。

这一案例也说明功能一词需要分层。一个神经元的内在放电性质，不等于它在完整回路中的全部作用；轴突分布提示潜在连接范围，也不单独证明它在某种行为中的因果贡献。多模态一致显著加强类型判定，却没有一次性完成所有尺度的功能归属。将细胞分类用于回路研究，还需要把类型标签与具体连接和活动相联系。

空间测量可以检验候选群是否占据可重复的位置，或在不同区域呈现连续分布。但空间共存本身不证明直接相互作用，邻近也不等于同源。同一个解剖区域可以包含多个类型，同一种类型也可能分散在多个区域。因此空间证据应改变对类型范围与环境关联的判断，不能被简化为每块组织必须对应一个表达簇。

谱系追踪则针对另一种缺口。Weinreb等人2020年把造血过程中的转录状态与克隆后代联系起来，发现单细胞转录测量未能充分显出的命运偏向，并用实际后代关系检验快照推断。[40-4] 这项结论不应夸大为RNA与命运无关；它表明在该研究范围内，表达信息有预测力，同时仍遗漏某些影响后续去向的性质。

从这个结果出发，可以提出两种不同修订。较弱修订是在原有表达分类旁增加命运不确定性，不强迫每个群只有一个结局；较强修订则是在独立证据充分时，重新区分原来表达近似而潜能不同的群体。究竟采用哪一种，取决于差异能否重复、是否稳定以及研究任务是什么。不能因为出现预测误差就立即无限增加类型。

谱系证据也有自己的条件。追踪标签必须能够可靠反映共同来源，记录缺失不能任意解释为不存在亲缘，后代在观察系统中的生长差别也会影响可见结果。某种条件下显示的潜能不等于细胞在原组织中必然实现的命运。尤其在环境发生较大变化时，研究者需要区分原位贡献、条件性能力与实际已走过的历史。

将所有模态收集齐并不自动保证解释正确。若只挑选与初始聚类一致的功能读数，就可能形成循环确认；若不同测量来自无法对应的群体，平均一致又可能掩盖个体不一致。较强的整合需要保留对应关系和冲突，说明某项证据改变了哪条边界。不同模态之间出现张力，有时正是发现状态与类型被混同的最好机会。

这里E的含义不是把空间、功能、谱系列成三个外部条件，而是指出它们怎样共同约束同一对象的判定。例如，表达近似的两个群若稳定占据不同位置并具有不同活动，其差异就不能只按转录距离衡量；若空间差别消失后功能随之转换，原来的群又可能更适合解释为位置相关状态。断开这种互约束，会使任一维度独占身份裁决。

三式由此成为可以落实的审查。S=F(D,E)要求候选类型由获得数据的过程与跨模态约束共同支持；D=G(S,E)要求追加测量针对当前身份主张的缺口；E=H(S,D)要求互证关系接受实际不一致的修订。一个表达簇若缺乏功能差别，不能仅把这称作“功能尚未发现”；它也可能需要降格为状态分组，或在当前研究任务中与其他簇合并。

功能验证还应说明比较时是否控制了状态差别。同一类型的细胞处于不同细胞周期或活动水平时，可能表现不同；两个类型若恰好处于相近活动状态，也可能在某一读数上重合。因此一个功能任务没有区分两群，只能限制与该任务相关的分类主张，不能证明它们在任何意义上完全同一。反过来，一次功能差异也需要检查是否由可逆状态解释。

如果一种分类主要用于预测特定组织任务，它可以在该任务中有效，而不必成为所有研究共享的最细划分。这要求分类者公开粒度：某个亚群的合并可能适合比较代谢活动，却不适合比较神经连接。层级分类能够容纳这些用途，但层级之间的对应必须有证据支持，不能通过改换任务任意回避反例。

样本数量同样影响独立验证的含义。一个极少见候选群可能只在少数个体中被取到，暂时无法检验其稳定边界；此时保留候选标签比强行合并或正式命名都更合适。后续扩大观察应优先解决它是否稳定出现、是否具有一致来源，而不是只增加同一批次中的相似记录。

四 何时保留旧分类

新技术的分辨率提高，并不要求每次都重写细胞名称。旧类型若在形态、组织位置和功能上具有稳定意义，新表达簇可能适合作为其内部状态或亚型，而不是替代整个类别。保留旧分类不是拒绝新证据，而是保护已经建立的跨研究对应。只有新边界能够解决原边界不能处理的问题时，改名和拆分才获得充分理由。

可以设想一个明确比较：旧类中的细胞被表达分析分为两群，二者在多批次中重复出现，但其比例随短期刺激迅速改变，且独立功能差别随刺激撤去而消失。在没有其他稳定依据时，将它们称作同一类型的两种状态更为节制。这个设例并不规定所有可逆差异都不能构成亚型，而是要求类别名称与所承担的稳定性主张相称。

另一种情形则支持修订。若两个群在多个个体与平台中重现，预测不同的空间组织与功能，并且既有类型标签持续掩盖这些差别，那么继续合并会损失解释力。此时扩充分辨率具有实际用途，例如让过去看似相互矛盾的实验结果得到清楚分组。对象边界的改写应以这种解释收益为依据，而不是以新增类型数量作为成绩。

跨平台重复也要防止表面一致。两个研究使用同一参考标签自动注释，得到相同名称，并不等于它们独立恢复了相同结构。共享参照有助于交流，却可能共同继承错误。比较需要查看哪些证据来自各自数据，哪些来自预先指定的对应关系，并给不确定匹配保留空间。名称相同与身份得到独立支持，仍是两件事。

最强的竞争解释来自单细胞研究自身。统计方法已经研究批次效应、采样误差和模型稳健性，多模态生物学也早已要求功能与空间验证。本书不能把这些成熟实践包装为SDE首次发现。能够检验的增量，是在跨章比较时明确区分显露、功能归属与对象身份，识别哪一项证据只支持其中一层，并使后续取证因此改变。

这一增量可以通过具体决策衡量。加入身份审查之后，是否减少了把应激簇命名为新类型的错误？是否促成补充谱系记录，从而纠正伪时间方向？是否在独立功能一致时保留旧类，避免分类体系无必要分裂？若没有这些可记录的差别，理论框架便主要起整理作用。整理依然有价值，但不应被描述为已经建立新的预测机制。

细胞图谱因此应当具有版本意识。类型标签、判据、样本范围与不确定对应都可以更新，同时保留从旧版本到新版本的映射。这样，后续研究不会因为名称变化而失去旧证据，也不会因为旧名稳定而掩盖概念已变。可追溯修订让分类既能积累，又能纠错，正是本书所要求的实践回写。

第七、八编从遗传物质、调控机制和发育差异走到细胞图谱，呈现的并非生命单位越来越小的一条直线。分子解释能够细化功能，组织与谱系证据又会把细胞放回较大的关系中。一个可靠的细胞类型，是在明确条件内能由多条证据持续辨认的研究单位；表达簇提供极有力的入口，而它何时成为类型，仍要由实际比较共同决定。